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十年行医以及阅读古典医籍的过程中，发现古代本草书中存在着不少错误，决心重新编纂一部本草书籍，着手开始编写《本草纲目》，以《证类本草》为蓝本，参考了800多部书籍，其间，多次离家外出考察，足迹遍及湖广、江西、直隶许多名山大川，弄清了许多疑难问题。
在编写《本草纲目》的过程中，最使李时珍头痛的就是由于药名混杂，往往弄不清药物的形状和生长的情况。过去的本草书，虽然作了反复的解释，但是由于有些作者没有深入实际进行调查研究，而是在书本上抄来抄去，所以越解释越糊涂，而且矛盾百出，使人莫衷一是。例如药物远志，南北朝著名医药学家陶弘景说它是小草，像麻黄，但颜色青，开白花，宋代马志却认为它像大青，并责备陶弘景根本不认识远志。又如狗脊一药，有的说它像萆薢，有的说它像拔葜，有的又说它像贯众，说法很不一致。在他父亲的启示下，李时珍认识到，读万卷书固然需要，但行万里路更不可少。于是，他既搜罗百氏，又采访四方，深入实际进行调查。
经过27年的长期努力，完成《本草纲目》初稿，时年61岁，以后又经过10年三次修改，前后共计40年，直到去世，逝世后的第三年，《本草纲目》在金陵正式刊行。